近日，Nano Letters 報道了香港理工大學(xué)賴溥祥教授團隊、華南師范大學(xué)詹求強教授團隊、中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院鄭煒研究員團隊和中國科學(xué)院自動化所惠輝研究員團隊聯(lián)合獲得的新成果，相關(guān)工作“Deep-Penetrating and High-Resolution Continuous-Wave Nonlinear Microscopy Based on Homologous Dual-Emission Upconversion Adaptive Optics”（ Nano Letters 25, 5485-5492 (2025). https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.5c01030 ）展示了一種基于同源雙發(fā)射上轉(zhuǎn)換自適應(yīng)光學(xué)的深穿透高分辨率連續(xù)波非線性顯微鏡。該方法利用 Tm3+ /Yb3+ 共摻雜 UCNP 的 455 nm/800 nm 雙發(fā)射：800 nm 發(fā)射用于深層組織中的像差測量（導(dǎo)星），455 nm 發(fā)射用于相應(yīng)深度的高分辨率成像。我們利用自制的 975 nm 連續(xù)激光器的非線性激光掃描顯微鏡，在存在顯著光學(xué)像差的小鼠腦組織環(huán)境中，實現(xiàn)了 500 μm 深度近衍射極限的成像（橫向 480 nm）。該策略拓展了上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNP）的應(yīng)用，并對深層組織光學(xué)特性的探索提供了新的思路。

該工作利用晶萃光學(xué)JCOPTIX提供的BS分束鏡產(chǎn)品實現(xiàn)了同時的近紅外波前探測和高分辨成像。

非線性光學(xué)顯微鏡 (NLOM)，以多光子顯微鏡 (MPM) 為例，利用非線性光與物質(zhì)相互作用產(chǎn)生熒光進行成像。在過去的 20 年中，NLOM 已被廣泛應(yīng)用于揭示細胞結(jié)構(gòu)、生物分子分布以及生命過程的動力學(xué)。在這些應(yīng)用中，成像分辨率通常隨著非線性階數(shù)的增加而提高，然而，由于傳統(tǒng)的非線性熒光團由于其吸收截面較小而表現(xiàn)出低階非線性，因此實際應(yīng)用中的非線性度受到限制。因此，高強度超快飛秒激光脈沖對于產(chǎn)生足夠的非線性信號至關(guān)重要。此外，使用這些非線性熒光團時，諸如光漂白、光毒性和再激發(fā)背景等問題也不容忽視。

上轉(zhuǎn)換納米粒子 (UCNP) 通常摻雜鐿敏化離子 (Yb3+)，最近被用作 NLOM 中的新型探針。與傳統(tǒng)非線性熒光團相比，UCNP 的能級壽命更長，從而能夠進行連續(xù)光子吸收過程，將高能近紅外激發(fā)轉(zhuǎn)換為多個反斯托克斯發(fā)射。這繞過了前面提到的非線性激發(fā)要求，從而可以使用更具成本效益且易于獲得的連續(xù)波 (CW) 近紅外激光器代替高強度飛秒激光器。此外，UCNP 固有表現(xiàn)出高階非線性，比傳統(tǒng)非線性熒光團具有更高的分辨率和更好的信噪比。

盡管 UCNP 具有這些優(yōu)點并且可以使用 NIR 激光激發(fā)來減輕散射，但深層組織中仍然存在像差，類似于傳統(tǒng) MPM 中遇到的像差。在深層組織成像中，光學(xué)像差和散射會破壞衍射極限焦點的形成，從而降低信號完整性、對比度和分辨率。傳統(tǒng)上，已經(jīng)開發(fā)出一種直接波前傳感自適應(yīng)光學(xué) (AO) 方法，通過校正散射介質(zhì)中沿激發(fā)路徑的像差來恢復(fù)到衍射極限焦點。該方法采用 Shack-Hartman 波前傳感器 (SH-WS) 通過在樣本內(nèi)部創(chuàng)建熒光導(dǎo)星 (GS) 來測量波前畸變。SH-WS 元件上的 GS 圖像的清晰度對于有效校正像差至關(guān)重要。然而，在哺乳動物大腦等組織中，強烈的散射會衰減形成 GS 的彈道熒光，并產(chǎn)生彌散的背景，從而遮擋彈道信號，使像差測量變得復(fù)雜。光學(xué)散射與波長相關(guān)，波長越短，散射越多。因此，雖然 UCNP 的可見光（VIS）GS 由于其高階非線性特性而提供了更好的成像質(zhì)量，但由于其易受散射的影響，它并非深層組織像差測量的最佳選擇。

本研究利用 Tm3+ 和 Yb3+ 共摻雜上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNP）在 975 nm 連續(xù)波激發(fā)下的同源雙發(fā)射特性，提出了一種基于同源雙發(fā)射上轉(zhuǎn)換自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)（HDU-AO）的深穿透高分辨率連續(xù)波非線性顯微鏡。UCNP 的近紅外（800 nm）發(fā)射由于散射小且波前與激發(fā)光畸變譜更接近，可作為靶標；可見光（455 nm）發(fā)射由于其四光子上轉(zhuǎn)換效應(yīng)，可用于高分辨率成像。通過比較發(fā)現(xiàn)，455 nm 發(fā)射具有更高的分辨率和信噪比，而 800 nm 發(fā)射則能夠更深入地穿透小鼠腦環(huán)境。隨后，我們證明了所提出的方法在體外成像中的適用性，通過將我們的方法集成到自制的非線性激光掃描顯微鏡中，我們可以在復(fù)雜的 500 μm 厚的小鼠大腦環(huán)境中清晰地分辨出橫向分辨率為 480 nm 的納米顆粒。

HDU-AO 的詳細流程如圖 1所示。UCNPs 同時摻雜了 Tm3+ 和 Yb3+ ，在 975 nm CW 激光激發(fā)下可發(fā)射兩種不同的上轉(zhuǎn)換波長：455 nm 的 VIS 光和 800 nm 的 NIR 光。如圖 1a 所示，與 NIR 光相比，VIS 光發(fā)射表現(xiàn)出更高的非線性效應(yīng)，從而產(chǎn)生了更清晰的點擴展函數(shù) (PSF)，因此適合用于成像。相反，NIR 光發(fā)射可用作像差校正的 GS，因為與 VIS 光發(fā)射相比，NIR 光散射更少，并且與激發(fā)光的畸變輪廓的對準程度更高。這樣，SH-WS 可以捕獲由光斑矩陣組成的更清晰、更明亮的圖像（ 圖 1b）。通過利用 800 nm 發(fā)射作為深層組織中校正的 GS，我們可以使用 455 nm 發(fā)射實現(xiàn)高分辨率 AO 成像，即使在具有挑戰(zhàn)性的深度下也是如此（圖 1c）。

1）光控可見光和近紅外輻射的成像對比分析

如圖 2 所示，對 VIS 和 NIR 發(fā)射的成像質(zhì)量和穿透能力進行了比較分析。 圖 2a 顯示了使用 VIS 和 NIR 發(fā)射的 UCNP（無散射蓋）的掃描顯微圖像。 如圖 2a 所示，與 455 nm 發(fā)射的結(jié)果相比，800 nm 發(fā)射的結(jié)果表現(xiàn)出明顯的背景噪聲。這主要是因為 800 nm 發(fā)射與雙光子激發(fā)過程有關(guān)（Slope800 = 1.69），這會導(dǎo)致相當大的失焦熒光背景。此外， 圖 2a （iii）和（iv）中所示的兩個 UC 珠的分辨率顯著提高，分辨率分別從 990 和 850 nm 提高到 610 和 590 nm。這些結(jié)果表明，VIS 發(fā)射提供了更高的 SNR 和更高的分辨能力（ 圖 2a ），這表明 VIS 發(fā)射更適合高分辨率成像。為了評估穿透能力，UCNP 樣本上覆蓋有來自 BALB/c 小鼠的各種小鼠腦切片（ 圖 2b ），厚度范圍從 100 到 600 μm，增量為 100 μm。隨著腦切片厚度的增加， 圖 2c 和 2d 分別顯示了 SH-WS 使用 VIS 和 NIR 發(fā)射捕獲的圖像。結(jié)果表明，VIS 發(fā)射的點圖變得模糊且難以區(qū)分，特別是在厚度超過 300 μm 時，而 NIR 發(fā)射的點圖在整個實驗過程中仍然清晰可辨。 這表明近紅外光發(fā)射更適合用作光譜儀。由于可見光和近紅外光發(fā)射同源，HDU-AO 提供了一種穩(wěn)健而直接的策略，可在連續(xù)波激發(fā)下實現(xiàn)深層組織的高分辨率成像。

首先利用所提出的方法研究了折射失配引起的像差。將長方體和傾斜的聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 片（折射率：1.41）分別放置在物鏡和樣品之間，導(dǎo)致明顯的折射失配（ 圖 3a 和 3g ）。分析了 SH-WS 捕獲的每種 PDMS 類型的點圖（ 圖 3e 和 3k ），然后使用點移圖和澤尼克多項式重建像差（ 圖 3f 和 3l ）。計算結(jié)果表明，長方體 PDMS 配置主要引起球面像差（ 圖 3f ），而傾斜配置會引入明顯的彗差和像散（ 圖 3l ）。我們在此處以 ～25 kW/ cm2 的激發(fā)功率密度采集圖像。校正后，可以觀察到納米顆粒圖像的銳度和清晰度顯著增強（ 圖 3b 和 3h ）。值得注意的是，由于不對稱像差導(dǎo)致急劇變形的納米顆粒在校正后恢復(fù)了正常的圓形（ 圖 3h ）。為了更具體地證明其有效性，從全視場中提取了來自三個不同視角的單珠圖像（ 圖 3c 和 3i ）。如圖所示，校正后，不需要的鬼影信號被有效消除，橫向和軸向分辨率以及峰值信號強度均得到顯著提高， 如圖 3d 和 3j 所示，分別顯示了每種 PDMS 類型的橫向 (i) 和軸向 (ii) 強度分布。

為了評估我們的 HDU-AO 方法在深層組織環(huán)境中的性能，我們對從 BALB/c 小鼠中獲得的 500 μm 厚的固定鼠腦切片覆蓋的樣本進行了成像（ 圖 4a ）。如果不進行校正，激發(fā)波前會被腦切片嚴重扭曲，使得信號與背景噪聲無法區(qū)分（ 圖 4b ）。如圖所示，像差校正顯著提高了可見度和分辨率，這通過圖 4b 中彩色編碼的側(cè)面圖像的比較可以證明。光斑移動圖和像差圖案顯示，500 μm 腦切片的散射主要導(dǎo)致球面像差（ 圖 4c (i) 和 c(ii)）。在這里，我們在 500 μm 小鼠腦切片之前以 ～60 mW 的激發(fā)功率采集了圖像。為了定量驗證像差校正能力，我們選擇了兩個不同深度（522 和 530 μm）的圖像（ 圖 4d -g）。值得注意的是，522 和 530 μm 深度處的四個子區(qū)域的放大圖像顯示信號和分辨率均明顯增強（ 圖 4d-g）。組織散射導(dǎo)致物鏡焦平面焦點扭曲，嚴重降低了 VIS 信號的激發(fā)效果，導(dǎo)致一些大納米顆粒的形態(tài)彌散（ 圖 4d(ii) 和 f(ii)）并且無法激發(fā)大多數(shù)納米顆粒（ 圖 4d(iii) 和 f(iii)）。校正后，VIS 信號可以被準確激發(fā)，提供高分辨率和高信噪比，峰值強度增強 5 倍以上（ 圖 4h）。 此外， 圖 4d–g(iv) 所示的傅里葉光譜表明，經(jīng)過 HDU-AO 校正后，更多高頻成分變得清晰可見。尤其值得一提的是， 圖 4h(ii) 和 4h(iv) 中的傅里葉光譜和強度分布均表明分辨率達到約 480 nm，類似于在沒有強散射的情況下的衍射極限成像。這些結(jié)果表明，在以近紅外光作為自適應(yīng)光學(xué)的導(dǎo)星進行像差校正后，HDU-AO 可以實現(xiàn)深層組織中可見光發(fā)射的高分辨率成像。

本研究介紹了一種基于同源雙發(fā)射上轉(zhuǎn)換自適應(yīng)光學(xué)器件的連續(xù)波非線性成像顯微鏡，這是一種利用 Tm3+ 和 Yb3+ 共摻雜的上轉(zhuǎn)換自適應(yīng)光學(xué)納米顆粒（UCNP）實現(xiàn)深層組織高分辨率成像的創(chuàng)新方法，該納米顆粒在 975 nm 連續(xù)波激發(fā)下能夠同時發(fā)射 455 nm 和 800 nm 波長。UCNP 的這種雙發(fā)射特性為測量和校正像差以實現(xiàn)深層組織高分辨率成像提供了新的視角。通過利用 UCNP 的同源雙發(fā)射特性及其他優(yōu)勢，這種創(chuàng)新配置有效地克服了傳統(tǒng)聲光在深層組織中的局限性，在腦切片至少 500 μm 的深度范圍內(nèi)實現(xiàn)了約 500 nm 的分辨率，同時將背景信號降至最低。

香港理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系2021級博士生姚靖為本文第一作者，賴溥祥教授、詹求強教授、鄭煒研究員和惠輝研究員為本文共同通訊作者。香港理工大學(xué)余志鵬博士、中科院深圳研究技術(shù)研究院博士生高玉峰、華南師范大學(xué)王保舉博士給予了重要建議與指導(dǎo)。本工作在國家自然科學(xué)基金和the Hong Kong Research Grant Council等項目的支持資助下完成。

作者特別感謝南京晶萃光學(xué)科技有限公司（JCOPTIX）提供的光學(xué)元件與儀器支持。